Диагностика генитального герпеса
Иммунофлюоресценция - антитела ВПГ-1 и ВПГ-2
Зачем нужна лабораторная диагностика, её роль в постановке диагноза.
Чтобы установить точный и полный диагноз необходимо учитывать особенности клинического развития болезни и использовать комплекс адекватных методов обследования. В каждом конкретном случае недопустимо устанавливать диагноз «генитальный герпес» только при визуальном осмотре и наличии везикул (мелких кожных пузырьков, содержащих жидкость). Подобные эрозивно-язвенные высыпания могут быть обусловлены и другими возбудителями (стрептококковой, стафилококковой, микотической, папилломавирусной инфекцией) а также наблюдаться при сифилисе, трихомониазе, аллергических реакциях и некоторых дерматозах. Более того, визуальная диагностика невозможна при глубоком поражении тканей и органов, при бессимптомном развитии заболевания.
Вирус простого герпеса (ВПГ) является одним из немногих вирусов, для выявления этиологической роли которого при инфекционных заболеваниях используются все лабораторные диагностические реакции – от цитологических исследований до молекулярно-биологических методов верификации. Одновременно необходимо проводить обследование на наличие сопутствующих возбудителей (хламидий, микоплазм, уреаплазм, простейших и других бактерий, вирусов).
Что исследуется - биологический материал из очага инфекции
Для постановки диагноза генитального герпеса (ГГ) необходимо исследовать материал, полученный непосредственно из полового тракта, а также биологические жидкости и секреты организма.
Для выделения вируса герпеса с целью диагностики герпетического заболевания используются:
содержимое герпетических пузырьков, кровь, слюна, спинномозговая жидкость, биоптаты шейки матки и других органов, цервикальный секрет, уретральные пробы, эякулят, секрет предстательной железы, соскобы и смывы с тканей и органов, моча, слизь, мазки-отпечатки с высыпаний и т.д
Что ищут в процессе исследования
Лабораторная диагностика заболеваний, вызванных ВПГ включает комплекс методологических подходов, цель которых состоит в обнаружении маркеров герпесвирусной инфекции, среди которых:
- геном вируса
- вирусные белки (антигены)
- инфекционные вирусные частицы
- цитопатогенное действие на клетки
- специфический иммунный ответ организма больного (его антитела)
Методы лабораторной диагностики
До недавнего времени лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций (ГВИ) производилась только в специализированных вирусологических центрах. Появление новых методов исследования привело к расширению возможностей вирусологической диагностики ГВИ в практическом здравоохранении.
Современные методы лабораторной диагностики ГВИ позволяют: получать результаты анализа в короткие сроки (часы, иногда — минуты), проводить и завершать анализ без выделения культуры вируса, используя только нативный материал; получать надлежащую достоверность анализа, учитывая высокую специфичность и чувствительность методов исследования.
В практической деятельности наиболее доступными методами диагностики являются:
- молекулярно-биологические – детекция вирусного генома методом полимеразной цепной реакции (ПЦР);
- иммуноморфологические – выявление антигена ВПГ с помощью прямой и непрямой иммунофлюоресценции (ПИФ и НИФ);
- серологические – выявление специфических антител к ВПГ (IgA, IgM, IgG) и антигена методом иммуноферментного анализа (ИФА);
- вирусологические – выделение вируса в культуре ткани из клинического материала и его идентификация;
- цитологические.
Молекулярно-биологические методы диагностики
К молекулярно-биологическим методам относится один из самых перспективных современных методов лабораторной диагностики – метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР, позволяет обнаружить единичные копии вирусной ДНК в клетках, биологических жидкостях (кровь, слюна, материал, взятый из уретры или цервикального канала) и биопсированных тканях.
Иммуноморфологические методы
Обнаружение вирусного антигена в клетках и жидкостях организма (клетках осадка мочи, слюны, лейкоцитах крови, мазков-отпечатков с герпетических высыпаний, шейки матки, биопсийного и аутопсийного материала) осуществляют с помощью метода иммунофлюоресценции, иммунопероксидазного и лантанидного методов.
В прямой монофлюоресценции используют антитела, меченные люминесцирующей сывороткой (изотиоционатом флюоресцеина), что позволяет выявить вирусный антиген по свечению клеток в люминесцентном микроскопе. Во втором случае применяют антитела, меченные пероксидазой. Вирусный антиген выявляют в обычном световом микроскопе по окрашиванию антигенсодержащих клеток хромогеном в темно-коричневый цвет. Разрабатываются также лантанидные методы, основанные на амплификации свечения.
Непосредственное выявление антигена в клиническом образце указывает на активную репликацию вируса и является методом, конкурирующим по надежности с методом выделения вируса в культуре тканей.
Серологические методы
Обнаружение в крови антител к ВПГ-2 не позволяет достоверно судить о наличии у больного ГГ, так как многие используемые коммерческие серологические наборы не способны точно различать антитела к ВПГ-1 и ВПГ-2 из-за высокого (70%) антигенного сродства обоих типов вируса.
Чувствительность большинства известных ИФА тест-систем для выявления ВПГ-инфекции варьируется в пределах 48–98,7% и зависит от исследуемого материала. Наличие перекрестных антигенных связей между штаммами, принадлежащими к ВПГ-1 и ВПГ-2 и другими типами герпесвирусов, требует определенной осторожности при интерпретации результатов лабораторных исследований.
В этой группе существует еще один метод – так называемый Western blot analysis: тестирование с помощью твердофазного иммунологического анализа электрофоретически разделенных белков или полипептидов. Метод высокоточен и позволяет дифференцировать антитела к ВПГ-1 и ВПГ-2.
Окончательные тесты на определение антител к ВПГ-2 должны основываться на детекции ВПГ2-типоспецифического поверхностного антигена – гликопротеина gG1–gG2. Чувствительность и специфичность серологических тестов на его основе при исследовании крови составляют 95–99 и 100% соответственно. В настоящее время типоспецифическая серология используется преимущественно в научно-исследовательских целях и не применяется в широкой клинико-лабораторной практике.
Вирусологическое исследование
Для диагноза заболевания важное значение имеет выделение вируса из пораженных тканей. Выделение вирусов в клеточной культуре включает выявление (индикацию) вируса и последующее его серотипирование. При подозрении на герпетическую инфекцию необходимо проводить многократное вирусологическое исследование материала, отделяемого из мочеполовой системы у пациентов, т.к. отрицательный результат однократного вирусологического исследования не исключает наличие урогенитальной герпетической инфекции. Повторное 2–4-кратное исследование (1 раз в неделю) повышает шанс выделения вируса в 2–3 раза.
Цитологическое исследование
Наиболее доступным, быстрым и дешевым методом исследования является цитологическое исследование инфицированного материала на ВПГ. Материалом для цитологического исследования может служить содержимое везикул, соскоб со дна эрозии, слизистой уретры, стенок влагалища, канала шейки матки.
Антитела к ВПГ-2. Подготовленный лабораторный препарат (ткань, зараженная ВПГ-2)
Специальным образом подготовленные образцы исследуют с помощью световой микроскопии. При цитологическом исследовании обнаруживаются многоядерные гигантские клетки с внутриядерными включениями.
Недостатками метода являются низкая чувствительность, сложность дифференциальной диагностики с другими вирусными инфекциями и зависимость от квалификации специалиста, проводящего исследование. Однако этот метод может быть применен как вспомогательное диагностическое средство. Электронная микроскопия в диагностике герпетической инфекции также рекомендована для экспресс-диагностики ВПГ-инфекции.
Выявление противовирусных антител классов M и G
Для подтверждения инфицирования вирусом герпеса определяют уровни специфических иммуноглобулинов Ig, относящихся к различным классам G и M (IgM, IgG), циркулирующих в биологических жидкостях и секретах организма больного (сыворотке крови, ликворе, слюне, слезной жидкости). Выявление специфических противогерпетических антител (IgM, IgG,) чаще всего осуществляют методом иммуноферментного анализа (ИФА). Редко используют классические методы: реакцию нейтрализации, реакцию связывания комплемента вируса герпеса (РСК). Из новых методов следует отметить иммуноблот (western blot) и иммунодот.
Детекция типоспецифических антител позволяет определить наличие и тип герпетической инфекции по наличию М-антител, нарастанию G-антител к одному или двум вирусам. Достоверные результаты получают при исследовании парных сывороток крови больного, взятых в начале заболевания (3-7 день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.
IgM детектируются через неделю после заражения. Специфические IgG антитела обычно появляются через 2-3 недели после первичного инфицирования.
Выявление специфических иммуноглобулинов IgM в отсутствии IgG или при 4-кратном увеличении титров специфических IgG в парных сыворотках крови, полученных от больного с интервалом 10-12 дней, свидетельствует о первичном заражении.
Выявление специфических иммуноглобулинов IgM на фоне IgG при отсутствии достоверного роста титров IgG в парных сыворотках говорит об обострении хронической герпетической инфекции.
Выявление титров IgG выше средних является показанием к дополнительному обследованию пациента и выявлению выделения вируса герпеса в средах.
Итоговый вывод
Таким образом, анализ методов, позволяющих подтвердить клинический диагноз «генитальный герпес», свидетельствует о разнообразии подходов к детекции вируса простого герпеса с учетом различных локализаций, манифестных и бессимптомных (наиболее проблематичных) стадий заболевания. Следует подчеркнуть, что ни один из методов лабораторной диагностики не обладает 100%-ной чувствительностью и специфичностью. Повышение достоверности лабораторной диагностики за счет исключения ложноотрицательных и ложноположительных результатов достигается путем одновременного применения нескольких методов тестирования, базирующихся на разных принципах.
Читайте также: