Нетрепонемные тесты на сифилис

Описание нетрепонемных тестов на сифилис

Тесты
Нетрепонемные тесты определяют антитела к липоидным антигенам тканей хозяина или возбудителя. С помощью нетрепонемных тестов выявляются IgM и IgG антитела (реагины) к липидам клеточной стенки бледной трепонемы. Эти антитела появляются в крови в количестве достаточном для определения с помощью тестовых реакций примерно через неделю после появления твердого шанкра.  

Преимущества нетрепонемных реакций — низкая стоимость и высокая чувствительность (особенно на ранних этапах заболевания). К дополнительным плюсам нетрепонемных тестов можно отнести сравнительно короткое время, необходимое для получения ответа при постановке отдельных тестов; пригодность для проведения скрининга большого количества образцов. Кроме того, ряд современных нетрепонемных тестов выпускаются уже стандартизированными. 

К минусам большинства нетрепонемных тестов относят их сравнительно низкую чувствительность при первичном (70– 90 %) и позднем (30–50 %) сифилисе. Также в отдельных случаях проявляется феномен прозоны: при наличии избыточного количества антител в неразведенной исследуемой сыворотке реакция антиген-антитело блокируется, что ведет к появлению ложноотрицательных или слабоположительных результатов; в то же время, при разведении исходной сыворотки получаются резкоположительные результаты. Ещё одним недостатком является сложность, громоздкость и длительность постановки наиболее традиционного нетрепонемного теста — РСК (реакции Вассермана), что уже привело к выведению этого теста из повседневной медицинской практики.

Нетрепонемные тесты дают ложноположительные результаты до 2,5 %, чаще у женщин. Основными причинами ложноположительных нетрепонемных тестов являются: аутоиммунные заболевания (ревматизм, системная красная волчанка, системная склеродермия, узелковый периартериит, криоглобулиновая пурпура, саркоидоз), онкологические заболевания и болезни крови, некоторые вирусные и бактериальные инфекции, малярия, цирроз печени, наркомания, алкоголизм, беременность, эндокринные заболевания (сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит), старческий возраст и др.

Для нетрепонемных реакций нельзя использовать цельную кровь, они требуют применения микроскопа или центрифуги. Кроме того, неопытные сотрудники лаборатории нередко дают ошибочные заключения, поскольку результаты реакции оценивают субъективно. Надежность результатов нетрепонемных реакций, по данным исследований, колеблется в широких пределах.

Нетрепонемные тесты могут быть качественные или количественные. Количественные нетрепонемные тесты могут применяться для мониторинга ответа организма пациента на лечение. По изменению количественных нетрепонемных тестов судят о степени эффективности лечения сифилиса и устанавливают его излеченность. Снижение титров нетрепонемных тестов в 4 и более раза в течение года после лечения подтверждает эффективность проведенной терапии сифилиса и является критерием его излеченности. Повышение титров означает неизлеченную активную инфекцию.

В настоящее время считается, что положительные результаты нетрепонемных тестов не могут считаться достаточными для постановки диагноза сифилитической инфекции без дополнительного подтверждения в трепонемных тестах.

Основные нетрепонемные тесты

Из нетрепонемных тестов наиболее широко распространены:

  • РСКк Реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (реакция Вассермана).
  • МРП или РМП Микрореакция преципитации с плазмой или инактивированной сывороткой или ее аналоги, проводится с кардиолипиновым антигеном
  • RPR (РПР) Тест быстрых плазменных реагинов (Rapid Plasma Reagins) или экспресс-тест на реагины плазмы;
  • VDRL тест Исследовательской лаборатории венерических заболеваний (Veneral Disease Reseach Laboratory) 
  • TRUST Тест с окрашенным толуидиновым красным кардиолипиновым антигеном и непрогретой сывороткой (Toluidin Red Unheated Serum Test)
  • RST Реагиновый отборочный тест (Reagin Screen Test)  – тест на скрининг реагинов, тест отбора реагинов
  • USR Тест выявления реагинов непрогретой сыворотки (Unheated Serum Reagins) – тест на реагины с непрогретой сывороткой

  • Это наиболее известные нетрепонемные тесты, большая часть из которых ставится с визуальной расшифровкой результатов исследования. 

    Среди нетрепонемных тестов имеются 2 теста с микроскопическим считыванием результатов реакции:VDRL – Venereal Disease Research Laboratory;USR – тест определения активных реагинов плазмы (Unheated Serum Reagins).

    Таблица. Нетрепонемные тесты

    Улавливающая системаТест
    При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс АГ-АТ), выпадающий в виде хлопьев белого цвета Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР, РМП)
    Суспензия липосом, дающая видимую реакцию флоккуляции с АТ к липидным АГVDRL (Veneral Disease Research Laboratories; аналог МР)
    Смесь суспензии липосом с частицами угля, образующая темноокрашенные хлопья при захвате угольных частиц системой, построенной из комплексов АГ-АТRPR (ускоренный плазмареагино- вый тест; аналог МР)
    АГ VDRL, сорбированный на поверхности лунок микропланшета и реагирующий с АТ, определяемыми методом ИФАИФА (реагины)
    АГ VDRL, сорбированный на поверхности лунок микропланшета реагирует с АТ, определяемыми в реакции с эритроцитами, сенсибилизированными антивидовыми АТ к IgG и IgMSPEA (реакция гемабсорбции на твердой фазе)

    Некоторые общие характеристики нетрепонемных тестов на сифилис

    1. Материал для исследования

    В качестве материала для серологического исследования на бледную трепонему  используется тканевая жидкость (серум, от лат. serum - сыворотка), кровь, спинномозговая жидкость.

    2. Антикардиолипиновые антитела

    В организме больного сифилисом, на ранних стадиях инфекционного процесса, происходит активное размножение возбудителей заболевания — бледных трепонем. Вследствие иммунных реакций, за счет действия факторов неспецифического иммунитета, часть трепонем погибает. Гибель бактериальных клеток приводит к появлению значительного количества липоидных молекул из разрушенных клеточных мембран возбудителя заболевания. По отношению к ним иммунная система макроорганизма продуцирует защитные антитела (реагины). 

    Кроме того, инфицированные бледной трепонемой ткани разрушаются; повреждающиеся при этом клеточные митохондрии высвобождают мембранные фосфолипиды, в том числе кардиолипин. Кардиолипин - аутоантиген (собственный антиген организма) липидной природы, появляющийся в организме при деструкции клеток и имеющий антигенный перекрест с липидными антигенами бледной трепонемы. Определенный уровень антител к кардиолипину присутствует в крови здоровых людей, но нарастание уровня антител к кардиолипину является важным скрининговым маркером в серологической диагностике. 

    3. В основе нетрепонемных тестов на сифилис лежит определение антител к кардиолипину. 

    В 1906 году немецкий микробиолог Вассерман (A. Wassermann) с коллегами разработали метод лабораторной диагностики сифилиса, основанный реакции связывания комплемента («реакцию Вассермана»). Связывание комплемента происходило при взаимодействии антител из сыворотки крови больных сифилисом и «сифилитического антигена». В качестве антигена использовался солевой экстракт из печени плода с врожденным сифилисом. 
     
    Антитела, определяемые этим методом в сыворотках больных сифилисом (т.наз. «вассермановские антитела»), получили название «реагины». Несмотря утвердившийся термин, к истинным IgE реагинам, обусловливающим развитие иммунопатологических реакций I типа (анафилактический шок, атопии), они не имеют отношения. Также эти антитела традиционно называются неспецифическими или нетрепонемными.

    В течение последующих трех десятилетий исследователи обнаружили, что в качестве антигенного материала могут использоваться спиртовые экстракты разнообразных тканей, не зараженных сифилисом и полученных из органов здоровых животных. В 1941 году Mary C. Pangborn установила, что одним из трех активных антигенных компонентов в опытах Вассермана является фосфолипид, названный кардиолипином (два других — лецитин и холестерин), а реакция Вассермана может успешно ставиться с помощью спиртового экстракта бычьего сердца в качестве антигена.  

    Таким образом, антиген в реакции Вассермана — это кардиолипин, фосфолипид, входящий в состав митохондриальных мембран. Его получают из бычьего миокарда — ткани, богатой митохондриями. 

    Кардиолипин является важнейшим компонентом внутренней митохондриальной мембраны клеток млекопитающих и растительных клеток. Кардиолипин составляет около 20% от всех липидов, и участвует в работе множества ферментов, вовлеченных в митохондриальный энергетический метаболизм. Также кардиолипин является составляющим компонентом мембран большинства бактерий, в том числе и клеточной стенки T. рallidum. 

    В дальнейшем, во многих, разработанных в 20-м веке тест-системах для диагностики сифилиса, использовался сходный принцип, связанный с определением антител к экстрагированному кардиолипину. Нетрепонемные тесты на основе кардиолипинового антигена выявляют антитела против липидных антигенов, например, такие, как реакция микропреципитации (РМП) или аналог — RPR (быстрый плазмореагиновый тест), а также реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСКк) . 

    4. В современных нетрепонемных тестах применяется антиген нетрепонемного происхождения (стандартизованный кардиолипиновый антиген). 

    После работ Pangborn, выделившей кардиолипин и очистившей лецитин, специалисты по серологическим исследованиям смогли разработать кардиолипин - лецитин - холестериновый антигенный комплекс нетрепонемного происхождения, который в настоящее время стандартизован и используется в коммерческих тест-системах. Для приготовления кардиолипинового антигена в промышленных условиях используется сложная пропись очищенных липоидных субстанций; кардиолипин – 0,027-0,03%, лецитин – 0,27-0,28% и холестерин – 0,9-0,98%, растворенных в этиловом спирте.

    5. Типы антител, выявляемые в нетрепонемных тестах на сифилитическую инфекцию. 

    В основе нетрепонемных тестов лежит выявление антител к антигенным структурам наружной мембраны T. рallidum, состоящей из фосфолипидов. Точно неизвестно, какие именно антитела определяются нетрепонемными тестами с кардиолипин-лецитин-холестериновым антигеном. Фосфатидилхолин и кардиолипин составляют лишь небольшую долю липидов Т. pallidum. Кроме того, трепонемы инкорпорируют эти липиды из поврежденных тканей хозяина. Продукция антител, определяемых в этих тестах, фактически может отражать аутоиммунный ответ хозяина на слегка измененный кардиолипин (своего рода неоантиген) и/или его иную презентацию.

    6. Принцип постановки нетрепонемных тестов

    Принцип постановки нетрепонемных тестов основан на специфическом взаимодействии кардиолипинового антигена и реагинов с образованием рыхлого осадка в виде различной величины хлопьев (феномен флоккуляции, или преципитации). Исследование проводят ручным неавтоматизированным способом в лунках иммунологических планшетов или пластиковых карточек. Для обеспечения оптимальных условий перемешивания реакционной среды применяют шейкеры с горизонтальной платформой. учет результатов исследования осуществляют визуально с применением лупы с двукратным увеличением. 

    Образование хлопьевидного осадка оценивают в условных единицах, «плюсах»: от + до ++++. при обнаружении реагинов в образце в пределах ++++ проводят полуколичественную оценку их содержания путем исследования серии последовательных двукратных разведений этого образца (от 1:2 до 1:516 и выше); последнее разведение, в котором регистрируют позитивные результаты, считается количественной мерой (титром) содержания реагинов в пробе. 

    7. Типы реакций, используемых в нетрепонемных тестах

    По типу используемых  иммунологических методов  нетрепонемные тесты делятся на несколько групп:
    • РСК (реакция Вассермана);
    • флокуляционные (РМП, RPR, VDRL, USR, TRUST);
    • иммуноферментные (ИФА).

    8. Нетрепонемные тесты позитивируются через 1–2 недели после образования первичной сифиломы

    Первичная сифилома (твердый шанкр) — это клиническое проявление защитных процессов, включающих местные клеточные и гуморальные специфические реакции, направленные на уничтожение бледных трепонем в месте их первоначального внедрения.  

    Во время инкубационного и в начале первичного периодов возбудители сифилиса попадают с током крови в небольшом количестве во все органы и ткани, не вызывая ни клинических, ни гистопатологических изменений, но обусловливая антигенное раздражение иммунокомпетентных клеток. Т - лимфоциты приобретают специфическую фагоцитарную активность и вступают во взаимодействие с трепонемами, а В - лимфоциты трансформируются в плазматические клетки с последующим синтезом гуморальных противотрепонемных антител. В начале первичной стадии сифилиса (так называемый серонегативный первичный сифилис) в крови больных накапливаются специфические противосифилитические антитела, которые не выявляются нетрепонемными серологическими тестами (реакция Вассермана и осадочные реакции остаются отрицательными).

    При первичном сифилисе продолжается начавшаяся еще во время инкубационного периода иммунологическая перестройка организма, постепенно нарастает содержание в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов как ответ на антигенное раздражение, вызванное бледными трепонемами. Примерно в середине первичного периода, через 2 — 4 недели после образования твердого шанкра, становятся положительными так называемые реагинные реакции (реакция Вассермана и осадочные), что служит основанием к разделению первичного периода на серонегативную и серопозитивную стадии.  

    9. Ложноположительные результаты нетрепонемных тестов

    Нетрепонемные тесты определяют антитела к липоидному материалу, высвобождаемому из повреждаемых при сифилисе клеток макроорганизма, а не антитела непосредственно к бледной трепонеме. Эти антитела формируются как иммунный ответ на липидные антигены, являющиеся общими для бледной трепонемы и тканей организма человека. Вследствие антигенной общности с тканевыми фосфолипидами, антитела к кардиолипину трепонем реагируют с тканевым (митохондриальным) кардиолипином. 

    Поскольку деструкция клеток не строго специфична для сифилитической инфекции, необходимо учитывать, что реагины способны формироваться в организме и при множестве других заболеваний и состояний. По этой причине в лабораторных тестах на основе кардиолипинового антигена могут возникать ложноположительные результаты. Кардиолипиновые тесты не отличаются абсолютной специфичностью для сифилиса и могут быть позитивны не только в присутствии возбудителя сифилиса, но и при повреждении тканей макроорганизма. 

    Повышенное поступление в кровоток липоидных элементов клеточных структур может также наблюдаться при целом ряде острых и хронических инфекций, а также особых физиологических или патологических состояниях макроорганизма, которые сопровождаются выраженными повреждениями или гибелью клеток. Поэтому положительные результаты  нетрепонемных тестов не могут трактоваться  как безусловное  наличие инфекции  T. pallidum.

    Положительная реакция нетрепонемных тестов обнаружена у многих людей, не имеющих клинических и эпидемиологических признаков сифилитической инфекции. Наиболее часто хроническая ложноположительная реакция выявляется при аутоиммунных, воспалительных и гематологических заболеваниях. 

    Истинные аутоантитела против тканевого кардиолипина образуются при “антимитохондриальном (антифосфолипидном) синдроме”, обусловливая положительные реакции нетрепонемных тестов (применительно к возбудителю сифилиса  — ложноположительные), при коллагенозах (системная красная волчанка, ревматоидный артрит), проказе и других тяжелых инфекциях, связанных с повреждением тканей, при гемолитической анемии, при наркоманиях. Ложноположительная реакция особенно характерна для СКВ, при которой частота ее обнаружения достигает 30—44%. 

    Показания к применению нетрепонемных тестов

    Нетрепонемные тесты являются свидетельством активности заболевания, а также используются для скрининга и оценки эффективности проведенного лечения (в количественной постановке). Основными показаниями к применению нетрепонемных тестов  в клинической практике являются: 

    1. Проведение добровольного тестирования некоторой части популяции в медицинских учреждениях (скрининга населения) для выявления сифилиса. 

    Нетрепонемные тесты недороги, доступны, просты для постановки и отличаются быстрым сроком исполнения. Поэтому они используются для скрининга сифилиса в качестве отборочных реакций. Скрининг позволяет эффективно выявлять формы сифилиса с явно проявляющимися симптомами, а также потенциальных пациентов с сифилитической инфекцией среди больных с соматическими заболеваниями. Для окончательной постановки диагноза, бывает недостаточно результата скрининговых тестов, но они необходимы, чтобы наметить тактику дальнейших действий.

    Нетрепонемные тесты являются отборочными тестами, а не подтверждающими. По их положительным результатам выставлять диагноз сифилиса нельзя, он должен быть подтвержден специфическими трепонемными тестами. Положительный результат нетрепонемного теста без подтверждения в трепонемном тесте не может служить основанием для постановки серологического диагноза сифилиса. Если при первичном обследовании нетрепонемный тест дает положительный результат, то для постановки диагноза необходимо провести любой специфический подтверждающий трепонемный тест (РПГА, ИФА, РИФ, РИТ). 

    Пациенты, показавшие при скрининге положительные результаты трепонемных или нетрепонемных тестов, должны дополнительно обследоваться в условиях медицинских организаций дерматовенерологического профиля. Все обследуемые лица с позитивным результатом отборочного теста должны быть направлены к венерологу, который с учетом клинических данных и анамнеза решает вопрос о дальнейшем комплексном серологическом обследовании и лечении.

    В США проводились исследования для оценки с позиций "цена — эффективность" применения для первичного скрининга на сифилис алгоритма, основанного на выборе трепонемного теста в качестве первоначального. Показаны несколько более высокая стоимость первичного применения иммуноферментного или иммунохемилюминесцентного анализов и более частое назначение специфического лечения по сравнению с первичным исследованием в нетрепонемных тестах. 

    Скрининг трепонемные тесты

    Целесообразность выбора указанного алгоритма подтверждается данными практической медицины. У части пациентов, ранее переболевших сифилисом и получивших специфическое лечение и при этом показывающих отрицательные результаты в РМП или RPR, но положительные в трепонемных тестах, нередко при углубленном обследовании выявляются клинические признаки специфического поражения висцеральных (внутренних) органов или центральной нервной системы. Таким образом, вне зависимости от уровня превалентности (распространенности) сифилитической инфекции в популяции представляется целесообразным проведение скрининга населения на сифилис с применением трепонемных тестов, обладающих высокими показателями клинической эффективности. 

    2. В  составе комплекса серологических реакций, в сочетании с трепонемными тестами для серодиагностики сифилиса.

    В состав классического комплекса серологических реакций входят трепонемный и нетрепонемный тесты: 
    • реакция связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами (реакция Вассермана с трепонемным антигеном) 
    • реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном (РМП)
    В связи с разработкой более чувствительных, специфичных и менее трудоемких реакций, чем реакция Вассермана, в актуальном приказе Минздрава РФ рекомендуется при постановке КСР заменить реакцию связывания комплемента на ИФА или РПГА также в сочетании с РМП.

    3. Диагностика сифилиса с определением активности инфекции (определение титров антител).  

    4. Контроль эффективности специфической терапии путем определения титра антител  

    Для контроля излеченности сифилиса во всем мире используют нетрепонемные тесты. Для наблюдения за динамикой титра антител и контроля эффективности лечения необходимо использовать тот же нетрепонемный тест, который был применен при постановке диагноза (так как титры, к примеру, VDRL и RPR, не обязательно коррелируют).

    Реагины, определяемые в нетрепонемных тестах при сифилитической инфекции, являются более лабильными (изменяющимися), чем антитела, обнаруживаемые в трепонемных тестах. После проведения адекватного специфического лечения их уровень постепенно снижается, и они перестают определяться. 

    Лечение считается успешным в случае снижения титра в 4 и  более раз в течение года. В соответствии с существующими критериями излеченности, снижение в нетрепонемных тестах титра реагиновых антител в 4 раза, определяемое у больного сифилитической инфекцией в течение года, является показателем успешно проведенного специфического лечения.  

    При этом длительное сохранение позитивности нетрепонемных тестов у больных после адекватной терапии сифилитической инфекции в ряде случаев в Российской Федерации является основанием для установления дополнительного диагноза «серологическая резистентность» и назначения этим пациентам дополнительного специфического лечения. Причина развития серорезистентности остается неизученной, однако доказано, что чем позже начато лечение,тем чаще развивается серорезистентность.

    5. Решение вопроса о реинфекции (повторном заражении) у пациентов, ранее переболевших сифилисом.

    Подтверждение реинфекции требует лабораторной проверки и дифференциальной диагностики с рецидивом заболевания. Для этого применяются нетрепонемные тесты (РМП, РПР, VDRL и другие аналогичные) в количественном варианте постановки и некоторые трепонемные тесты, а также производится динамическое наблюдение за уровнем антител.

    Преимущества и недостатки нетрепонемных тестов на сифилис

    1. Преимущества нетрепонемных тестов: низкая стоимость, техническая простота и быстрота получения результатов.

    Достоинствами нетрепонемных тестов являются их дешевизна, техническая простота и быстрое проведение теста, а также возможность полуколичественной оценки содержания реагинов путем титрования. 

    2. Недостатки нетрепонемных тестов

    • Низкая чувствительность при первичном сифилисе (70–90%) и поздних стадиях сифилиса (30–50%)
    • Ложноположительные результаты при технических ошибках и погрешностях при проведении исследования. Возможные причины —нарушение условий и методики проведения реакции, а также сроков хранения сыворотки; нестабильные характеристики антигена, выделенного из клеточных компонентов трепонем; различие ингредиентов, качества и рабочей дозы комплемента
    • Низкая специфичность —ложноположительные результаты (биологические ложноположительные реакции) при наличии других острых или хронических заболеваний и при некоторых состояниях организма (беременность, кардиопатология, аутоиммунные заболевания, острые состояния и др.) - более 3 % 
    • Субъективная оценка результатов
    • Ложноотрицательные результаты — при исследовании неразведенных образцов сыворотки, содержащих большое количество антител. Это происходит за счет т. н. феномена прозоны, когда при избыточном количестве антител в исследуемой сыворотке реакция антиген—антитело блокируется. Этот эффект может наблюдаться на ранних стадиях сифилиса и во вторичном периоде сифилитической инфекции, а также при обследовании пациентов с выраженной иммунной недостаточностью или сопутствующей ВИЧ-инфекцией. Для исключения этого феномена необходимо осуществлять разведение образцов сыворотки крови при проведении исследования, в особенности при обследовании популяций с высокой превалентностью сифилитической инфекции 
    • Не всегда достигается воспроизводимость и преемственность результатов. Необходимость приготовления и оценки качества рабочей суспензии кардиолипинового антигена в лабораториях, отсутствие автоматизации проведения этапов исследования и субъективный подход к учету его результатов не позволяют обеспечить высокую воспроизводимость и преемственность результатов нетрепонемных тестов, полученных в условиях различных диагностических лабораторий.

    Использование реакции связывания комплемента для диагностики сифилиса. РСКк — реакция связывания комплемента с кардиолипиновым АГ (Реакция Вассермана).

    Наиболее известным нетрепонемным тестом с визуальной расшифровкой результатов исследования является реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСКк) или т.называемая «Реакция Вассермана».

    1. История метода
    История трепонемных и нетрепонемных серологических тестов на сифилис берет свое начало с работы Вассермана, Нейссера и Брука (А.Wasserman, А. Neisser, С. Bruck), опубликованной 10 мая 1906 г. В своих исследованиях, эти ученые адаптировали реакцию связывания комплемента (РСК), представленную в 1901 году Борде и Жангу (J. Bordet, O. Gengou). 

    Вассерман и соавторы использовали постановку РСК со специфическим антигеном: в качестве антигена исследователи использовали водную вытяжку из печени сифилитического плода, полагая, что там содержится много бледных трепонем. По мнению авторов, реакция связывания комплемента могла оказаться полезной для оценки состояния иммунитета у больных сифилисом, 

    Исторически это был первый серологический тест на сифилис, который и получил название «реакции Вассермана» (РВ, RW). Этот тест стал важной вехой развития серологической диагностики сифилиса, и в настоящее время является самым известным среди тестов на сифилис. Реакция Вассермана имеет более чем столетнюю историю— с момента публикации работы и внедрения метода в медицинскую практику прошло более 100 лет. В последние годы этот метод тестирования на сифилис применяется реже, чем раньше, в связи с открытием более надежных и чувствительных тестов.

    2. Предназначение и краткое описание метода
    Этот тест выявляет антитела к липидным антигенам бледной трепонемы, а также липидам макроорганизма (кардиолипин, лецитин, холестерин), высвобождающимся из поврежденных бледной трепонемой клеток и тканей и имеющими перекрест с липидными антигенами T.pallidum. Эти антитела имеют историческое  название «реагины» или «Вассермановские антитела», что может вызвать некоторую путаницу с реагинами немедленной аллергии (антителами класса IgE)

    Метод основан на феномене связывания комплемента и является реакцией Борде–Жангу (Bordet - Gengou), адаптированной для диагностики сифилиса. Полное название теста  — «реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном».

    3. Принцип и технология постановки теста
    К сыворотке крови больного сифилисом добавляют кардиолипиновый антиген и комплемент внешнего происхождения. Если в в сыворотке крови больного есть реагиновые антитела, то они соединяются с антигеном, образуя иммунный комплекс «антиген-антитело», способный адсорбировать и связывать комплемент.
    Если же комплекс «антиген-антитело» не образуется, то комплемент остается свободным.

    Обычно комплемент — это смесь сывороток крови,  полученной от  5-10 здоровых морских свинок или высушенный комплемент.

    Кардиолипиновый антиген дает с сифилитической сывороткой и комплементом осадки, различаемые только микроскопически. Поэтому, чтобы выявить их макроскопически, используют т. н. гемолитическую систему, которая представляет собой оттитрованную смесь эритроцитов барана и кроличьей гемолитической сыворотки. С помощью гемолитической системы проводится индикация образования комплекса «реагины–антиген–комплемент». Гемолитическая система является в данном случае лишь макроскопическим индикатором. 

    Исследование проводят в две фазы. На первой фазе антигены и антитела помещают в условия, обеспечивающие их взаимодействие в присутствии комплемента. Для этого, смесь из обработанной сыворотки, разведенного в специальной пропорции антигена и подготовленного комплемента подвергают 45-минутной инкубации в термостате с температурой +37С. Затем, на второй фазе, к анализируемой смеси добавляют необходимое количество гемолитической системы и её снова помещают в термостат на 45-60 минут. 

    Если сыворотка крови принадлежит больному сифилисом, то комплемент связывается реагинами. и поэтому комплекс «эритроциты барана + гемолитическая сыворотка + комплемент» образоваться не может и эритроциты барана выпадают в осадок (т. е. реакция положительная). 

    При этом отсутствует гемолиз эритроцитов. То есть эритроциты индикаторной системы  (состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки) не разрушаются и в окружающую среду не выделяется гемоглобин. 

    Если же в крови больного нет антител к возбудителю, то в первой фазе реакции комплемент остается не связанным. Поэтому на второй фазе, при добавлении гемолитической системы, ею связывается свободный комплемент. В результате взаимодействия эритроцитов барана с гемолитической сывороткой в присутствии свободного комплемента происходит гемолиз эритроцитов. 

    РСК

    4. Учет результатов
    Позитивность реакции Вассермана (качество реакции) оценивают по степени выраженности гемолиза. При положительном результате наблюдается задержка гемолиза различной степени. Наличие или отсутствие гемолиза определяют визуально и оценивают по системе четырех крестов или плюсов. 

    (4+) — реакция резкоположительная. Полное отсутствие гемолиза. 
    (3+) — реакция положительная. Значительная задержка гемолиза. Гемолиз слабый, едва начавшийся. 
    (2+) — реакция слабоположительная. Значительный гемолиз. 
    (± )—  реакция сомнительная. Незначительная задержка гемолиза, выраженный гемолиз, незначительная мутность содержимого пробирки.
    (-) — полный гемолиз — реакция отрицательная. 
    Результаты реакции Вассермана

    Количественный метод Боаса

    Кроме качественной оценки РВ, имеется и количественная постановка ее с различными разведениями сыворотки (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых форм сифилиса и при контроле за успешностью терапии.

    У больных с резкоположительной реакцией (4+) ставится количественный метод Боаса.  Он позволяет установить титр антител в сыворотках с 4+ — позитивностью путем ступенчатых разведений от 1:5 до 1:320 и более (1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т. д.). Титром считается то наибольшее разведение сыворотки, в котором регистрируется положительный результат.  Знание титра антител имеет сущетвенное значение в диагностике клинических форм сифилитической инфекции. Титр реагиновых антител снижается после адекватной терапии, что в определенной мере позволяет судить об эффективности лечения. 

    Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный (4+) результат. 

    Для ранних форм сифилиса (первичный, вторичный, ранний скрытый, ранний врожденный) характерна высокая позитивность (4+–3+) и высокие титры RW – 1:80 – 1:320. При поздних формах сифилиса (третичный, поздний скрытый, поздний врожденный) позитивность меньше (3+–2+), а титр RW будет низким – 1:5 – 1:20 или вообще не будет определяться.

    5. При каких периодах заболевания лучше использовать

    Реакция Вассермана становится положительной лишь через 2 — 4 недели после возникновения первичной сифиломы (иногда позже), через 10 — 12 недели после заражения, причем титр реагинов постепенно нарастает и достигает максимума (1:160 — 1:32 0 и выше) при появлении генерализованных высыпаний (сифилис вторичный свежий).

    Затем титр реагинов постепенно падает и при вторичном рецидивном сифилисе обычно не превышает 1:80 — 1:120. При скрытом и третичном сифилисе, как правило, имеет место низкий титр реагинов (1:20 — 1:40). 

    Быстрое снижение титра реагинов вплоть до полной негативации во время противосифилитической терапии свидетельствует об ее эффективности.

    6. Чувствительность и специфичность
    Реакция Вассермана обладает недостаточной чувствительностью и специфичностью. Результаты исследования положительны приблизительно в 70% случаев при первичном сифилисе (спустя 1–4 недели после появления шанкра) и отрицательны почти у 30% пациентов с поздним (третичным) сифилисом. 

    7. Область применения метода

    РВ можно ставить в количественном варианте (титром называют последнее разведение, которое дает резкоположительный или положительный результат). Возможно постановка РВ с ликвором. РВ с кардиолипиновым антигеном может использоваться для скрининга.

    8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

    РВ может быть положительной у лиц, никогда не болевших и не болеющих сифилисом. Например, ложноположительные (неспецифические) результаты РВ наблюдаются у многих больных лепрой, иногда при малярии, аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка), распадающихся злокачественных новообразованиях, обширных инфарктах миокарда и других заболеваниях, а порой и у совершенно здоровых людей. Кратковременная неспецифическая позитивация РВ наблюдается у ряда женщин непосредственно перед родами и сразу после них, у наркоманов, после наркоза, приема алкоголя и т. п.

    Ложноположительная РВ, как правило, выражена слабо, т. е. выпадает чаще с низким титром реагинов (1:5 — 1:20), или положительная (3+) и слабоположительная (2+). В целом при массовых серологических обследованиях частота ложноположительных результатов РВ составляет около 0,1 - 0,15%.

    9. Особенности, преимущества и недостатки

    Реакция Вассермана сыграла важную роль в становлении современной сифилидологии, так как: 
    • способствовала установлению диагноза и длительности заражения при манифестных, скрытых формах инфекции, висцеральном сифилисе, 
    • обосновывала необходимость назначения превентивного лечения; 
    • способствовала установлению эффективности терапии (по снижению титров реакции). 
    Реакции Ваесермана присущи существенные недостатки, ограничивающие ее применение:
    1) недостаточна я чувствительность. 

    РВ отрицательная в начале первичной стадии, бывает негативной и у 1/3 больных третичным активным сифилисом с поражениями кожи, слизистых оболочек, костей, внутренних органов, центральной нервной системы, поздним врожденным сифилисом, ос обенно если они в прошлом подвергались лечению антибиотиками;

    2) недостаточная специфичность. 

    Основные недостатки реакции Вассермана: 
    • сравнительно низкая чувствительность 
    • наличие ложноположительных результатов
    • сложность постановки
    • необходимость предварительной подготовки исследуемых сывороток (прогревание)
    • необходимость тщательной подготовки исходных реагентов (титрование комплемента и гемолитической сыворотки, отмывка эритроцитов барана, разведение кардиолипинового антигена). 
    • реагенты и саму реакцию сложно стандартизировать 
    • постановка реакции в целом весьма трудозатратна 
    Кроме того, этот метод — длительно выполняемый, сравнительно дорогостоящий, субъективно интерпретируемый, часто дающий ложноотрицательные и ложноположительные результаты — не подлежит стандартизации, автоматизации и протоколированию результатов, а следовательно, не подлежит внешнему контролю. 

    Таким образом, отдавая должное исторической роли реакции, предложенной Wassermann, Neisser и Bruck, следует признать, что в настоящее время реакция Вассермана в её исходном исполнении — морально устаревший метод. После открытия реакции Вассермана были разработаны другие нетрепонемные тесты

    По вышеуказанным причинам, в США и западноевропейских странах вместо реакции Вассермана применяются другие стандартные нетрепонемные тесты.

    10. Модификации метода

    Реакция Колмера
    Чтобы до известной степени преодолеть недостаточную чувствительность РВ, применялась её постановка на холоде (реакция Колмера), которая оказалась более чувствительной, чем в классической постановке. В 1926 г. Kolmer предложил наиболее ценную модификацию РСК, при которой связывание антигена с антителом проходит при комнатной температуре, соединение комплекса антиген — антитело с комплементом — при 6—8 °C, период после добавки гемолитической системы — при 38 °С.

    Данная модификация РВ основана на феномене двухфазного связывания комплемента. Особенностью реакции Колмера является двухфазность температурных режимов (первая фаза — при температуре 18-20 °С  в течение 30 мин, вторая — в холодильнике при температуре +4 – +6 °С в течение16-20 ч), при которых протекает связывание комплемента.

    Метод обладает более выраженной чувствительностью, чем РВ с кардиолипиновым антигеном, т.к. реакция Колмера улавливает реагины в тех сыворотках, где в силу их небольшой концентрации РВ, поставленная по обычной методике, дает отрицательный результат. 

    Ранее эта реакция рекомендовалась для использования в диагностических целях при первичном сифилисе и скрыто протекающей сифилитической инфекции.  Однако, по мнению большинства сифилидологов, реакция Колмера и РВ с кардиолипиновым антигеном при своей высокой чувствительности уступает в своей специфичности трепонемным модификациям РВ.

    Количественная методика Боаса
    В 1909 году Boas рекомендовал PCK с уменьшающимися объемами исследуемой сыворотки крови. В 1942 г. Kolmer предложил методику PCK с уменьшенным объемом ингредиентов (1/5). Эти методы сохранили ценность до настоящего времени.

    В случае получения резко положительных результатов реакций Вассермана и Колмера их ставят с уменьшающимися дозами испытуемой сыворотки для определения титра реагинов. Количественное определение реагинов помогает отдифференцировать ранний и поздний скрытый сифилис, а также позволяет легче оценивать эффективность противосифилитической терапии: снижение титра реагинов свидетельствует об эффективности лечения.


    Советские исследования по модификациям РСК
    Важным направлением в развитии серодиагностики сифилиса была разработка простых и экономичных модификаций РСК. Советскими специалистами были разработаны неиспользуемые в настоящее время модификации, которые можно было ставить в слабооборудованных лабораториях, в экспедициях и подобных же условиях с ограничением по обеспечению лабораторным оборудованием и реагентами. 

    Также применялась одновременная постановка РВ с другими серологическими реакциями. В СССР реакция Вассермана применялась в комплексе с двумя осадочными реакциями (Кана и Закса — Витебского). Иммунологическая сущность этих реакций ничем не отличается от РВ, но для них необходимо готовить более концентрированные антигены, которые при взаимодействии с реагинами сыворотки дают видимый глазом осадок, оцениваемый качественно (4+, 3+ и т. д.).

    В 70-е годы в СССР использовались регламентированые приказом Минздрава от 1974 года модификации РСК, одной из которых была реакция Григорьева -Раппопорта, осноснованная на применении в РСК естественного комплемента исследуемой сыворотки. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка с  разными титрами. Реакция Вайнштейна - Резниковой основывалась на использовании естественного комплемента и гемолизина испытуемой сыворотки.

    Цитохолевая реакция Закс-Витебского. Реакция Кана

    Данные реакции основаны на феномене образования мелкодисперсного хлопьевидного осадка (флоккулята или преципитата) при смешивании определенных липоидных антигенов с сывороткой или плазмой крови больных сифилисом. Осадочные реакции (реакция Кана и цитохолевая) также основаны на образовании комплекса антиген — реагины испытуемой сыворотки, проявляющегося макрофлоккулятом. 

    Реакция Закса-Витебского  (Sachs H., Witebsky E., 1928) — метод серодиагностики сифилиса, основанный на реакции преципитации, развивающейся в сыворотке крови больного при добавлении концентрированного цитохолевого антигена. Таким образом, это ускоренная реакция преципитации для серодиагностики сифилиса. Синоним — цитохолевая реакция.

    Реакция Кана (Kahn R.L., 1922) - серологическая реакция преципитации для диагностики сифилиса, в настоящее время не применяется. При смешивании ликвора или сыворотки крови больного сифилисом с холестеринизированным антигеном выпадают хлопья. Антиген приготовлялся из сердечной мышцы быка путем последовательной эфирной и спиртовой экстракции и прибавлением холестерина к экстракту. 

    Реакции Кана и цитохолевая Закса—Витебского много проще по технике выполнения по сравнению с РВ. Для их постановки используются более концентрированные антигены, которые содержат большое количество холестерина. При их постановке выпадает осадок, хорошо видимый невооруженным глазом (иногда для оценки результатов пользуются лупой или агглютининоскопом). 

    Осадочные реакции  регистрируют по 4-балльной системе: выпадение крупных хлопьев — 4+; средних — 3+; мелких — 2+ и отсутствие взвешенных частиц — отрицательная.

    Обе эти реакции долгое время применялись в комплексе стандартных реакций для диагностики сифилиса, фактически являлась одним из первых вариантов практического применения реакций преципитации. Реакции проводили в пробирках, при этом не требовалось присутствия комплемента; в качестве антигена применяли липидные антигены, приготовленные из сырья животного происхождения. 

    Согласно многочисленным данным, реакция Кана дает совпадающие результаты с реакцией Вассермана в 93-96% наблюдений (ее неспецифические результаты регистрируются в 1,6%), а реакция Закса-Витебского — в 95-99% (ее неспецифические результаты регистрируются в 1,3% наблюдений).

    В настоящее время, эти реакции не используются для диагностики сифилиса..

    Флокуляционные тесты (RPR, VDRL, USR, TRUST)

    Реакция преципитации (РП) — это выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена и специфического антитела в присутствии электролита.  Образующееся в результате реакции мутное кольцо или осадок называется преципитат. Разновидностью преципитации является реакция флоккуляции (по Рамону, Ramon)— появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) при при смешении токсина с соответствующей иммунной сывороткой (реакции токсин- антитоксин или анатоксин- антитоксин). Хлопьевидный осадок называется флоккулят. Реакция флоккуляции представляет собой преципитацию, при которой растворы антигенов и антител смешивают в пробирке.

    Вскоре после открытия комплементсвязывающего теста было установлено, что реакцию между вассермановским антигеном и сифилитическими сыворотками можно обнаружить по преципитации (флокуляции). Феномен образования преципитата при смешивании липоидного антигена с сывороткой или плазмой крови больного сифилисом был описан Michaelis в 1907 году. Это стало основой для разработки множества технических модификаций флокуляционного кардиолипинового теста на сифилис. Благодаря простоте, возможности стандартизации, дешевизне и скорости выполнения, они вытеснили из клинической практики классическую реакцию Вассермана и в настоящее время широко используются для скрининга сифилисной инфекции. 

    Осадочные тесты — цитохолевую реакцию Закс-Витебского и реакцию Кана — в течение длительного времени применяли в составе комплекса стандартных реакций (КСР) для диагностики сифилиса. Исследование проводили в пробирках, в качестве антигена использовали оригинальные прописи, включающие в себя кардиолипин, холестерин и лецитин в различных пропорциях, при этом не требовалось дополнительного введения комплемента. Образующийся комплекс микрофлоккулята был виден невооруженным глазом.

    В последующие годы при модификации с целью повышения качества кардиолипин-холестерол-лецитинового антигенного комплекса были разработаны и предложены различные коммерческие варианты методики выполнения флоккуляционных тестов (VDRL, USR, RPR, TRUST), отличающиеся как по техническим параметрам проведения реакции, так и по применяемому антигену (соотношению композитных частей).

    Флоккуляционные реакции на основе кардиолипинового антигена относят к нетрепонемным реакциям по причине того, что антиген получают не из возбудителя сифилиса (бледной трепонемы), а при технологическом соединении высокоочищенных биологических реагентов животного происхождения (холестерина, кардиолипина и лецитина). Соотношение ингредиентов антигена в настоящее время стандартизировано.

    РМП - реакция микропреципитации

    В настоящее время основным нетрепонемным методом серодиагностики сифилиса в России и многих странах СНГ является реакция микропреципитации (РМП).  РМП ставится или с инактивированной сывороткой крови, или с плазмой в день взятия крови из пальца. 

    1. Описание и принцип метода

    РМП представляет собой реакцию преципитации на стекле. Как и в реакции Вассермана, используется кардиолипиновый антиген. Реакцию проводят с плазмой крови или инактивированной сывороткой крови. Для постановки реакции кровь берут из пальца (получают плазму) или из вены (получают сыворотку). К плазме или сыворотке крови исследуемого добавляется эмульсия кардиолипинового антигена. Для приготовления эмульсии используется хлорид натрия и кардиолипиновый антиген, который изготавливается серийно. 

    Принцип РМП заключается в том, что при добавлении эмульсии кардиолипинового антигена к плазме или сыворотке крови больного сифилисом образуются хлопья преципитата белого цвета, а с плазмой или инактивированной сывороткой от здоровых лиц наблюдается отрицательная реакция в виде опалесценции. При постановке РМП с контрольными инактивированными сыворотками больных сифилисом анти­ген должен давать положительную реакцию. Антиген должен давать отрицательную реакцию с сыворот­ками здоровых лиц. Реакцию ставят в планшете для иммунологических реакций.

    Результаты РМП оцениваются визуально при достаточном освещении, по объему выпавшего осадка, величине хлопьев, и обозначаются в крестах или «плюсах» (от отрицательной «–» до «++++»). Результаты реакции учитывают, если в контроле отсутствует спонтанная преципитация.

    Реакция ставится в качественном и количественном вариантах. Качественная оценка реакции производится по объему выпавшего осадка, величине хлопьев и так же обозначается в «плюсах». Для получения результата необходимо всего 10-40 минут. РМП можно проводить и в количественном варианте: высоким считается разведение ≥ 1:16. РМП в количественной постановке применяется при обследовании больных сифилисом в процессе и после окончания лечения.

    РМП несколько превосходит RW по чувствительности, но уступает по специфичности. За рубежом применяются аналоги РМП – RPR и VDRL.

    2. Модификация метода

    Экспресс - метод (микрореакция на стекле): разновидность РМП, которую ставят с капиллярной кровью из пальца —«экспресс-метод». 

    Эта реакция также относится к липидным реакциям. Ставится со специальным кардиолипиновым антигеном и основана на реакции преципитации. Результаты оцениваются качественно как 4+, 3+, 2+ и отрицательные. Преимуществом экспресс-метода являются быстрота получения ответа (через 30 — 40 мин), небольшой объем необходимой для анализа крови (2 — 3 капли плазмы или сыворотки). Ложноположительные результаты при экспресс-методе получают чаще, чем при РВ, поэтому он разрешен для применения только как отборочная реакция при массовых обследованиях населения на сифилис и при обследовании больных в клинико-диагностических лабораториях соматических больниц. Окончательный диагноз сифилиса этим методом устанавливать запрещено. Экспресс-метод нельзя применять у беременных, доноров, а такж е для контроля после лечения больных сифилисом.

    3. Область применения метода РМП

    Простота схемы выполнения и низкая стоимость позволяют использовать тест РМП как отборочный, при установлении предварительного диагноза сифилиса. 

    4. При каких периодах заболевания лучше использовать метод РМП

    Положительный результат РМП регистрируется при клинической манифестации сифилиса, через 2–4 недели после образования первичной сифиломы (твердого шанкра), и обычно указывает на повреждение тканей. Применявшееся ранее деление первичного сифилиса на «серонегативный» и «серопозитивный» определялось именно по результату РМП и реакции Вассермана. 

    Период времени между инфицированием и появлением положительных результатов серологических тестов называют «серологическим окном». Вследствие этого, ограничено применение РМП на ранних стадиях сифилиса (период инкубации, начало первичного периода), так как данная реакция становится позитивной лишь спустя 2 недели после появления твердого шанкра, 

    Во вторичном периоде РМП положительна у 98–100 % больных, а при поздних формах сифилиса (третичный сифилис, поздний скрытый сифилис) – лишь у 60–70 %.

    Содержание антител-преципитинов в крови после адекватного специфического лечения сифилиса постепенно понижается, что находит отражение сначала в снижении титров, а затем и степени позитивности РМП, которая из резко положительной становится слабоположительной, а затем и отрицательной. В связи с этим РМП используют для оценки эффективности лечения и как один из критериев установления излеченности или при дифференциальной диагностике реинфекции.

    5. Достоинства и недостатки метода РМП

    Достоинства РМП: 
    1) дешевизна, простота и быстрота постановки (основной скрининговый метод); 
    2) РМП с определением титра используют для контроля излеченности сифилиса.

    Методика исследования с применением РМП проста в исполнении, недорога, не требует специального оборудования и не занимает длительного времени; при этом реакция демонстрирует приемлемую для скрининга чувствительность и специфичность.

    Недостатки РМП: 
    1) малая чувствительность при поздних формах сифилиса; 
    2) недостаточная специфичность. 

    Нетрепонемные тесты, и в т. ч. РМП, имеют невысокую чувствительность (до 70–77% при ранних формах сифилиса и до 30% при поздних формах) и часто дают ложноположительные результаты (более 3%). Нетрепонемные тесты могут быть отрицательными в 70% случаев при латентном и третичном сифилисе.
    Поздние стадии (поздний скрытый и третичный сифилис), так как лабильные преципитины первыми элиминируются из организма при длительном течении сифилитической инфекции. 

    6. Чувствительность и специфичность реакции РМП

    Большинство исследователей отмечают специфичность РМП на уровне 98%.  Чувствительность РМП меньше, чем у других стандартных, более современных нетрепонемных тестов, например у RPR. Чувствительность РМП колеблется в зависимости от стадии заболевания: при первичном сифилисе — 81%, при вторичном — 91%, при скрытых формах — 94%. 

    По данным ГУ «ЦНИКВИ Росздрава» (Приказ № 87 М3 РФ) чувствительность РМП при диагностике всех форм сифилиса составила 95,8%.

    7. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

    Ложноположительные результаты, наблюдаемые при скрининге сифилиса с использованием РМП, обусловлены:

    ~  наличием в крови антител к ревматоидному фактору; перекрестно реагирующими антителами у больных с аутоиммунной патологией, антифосфолипидным синдромом, пожилых людей, беременных женщин, больных боррелиозом и лептоспирозами, пациентов с обширной соматической патологией; нарушениями обмена липидов; иммунодефицитами различной этиологии.
    ~ техническими погрешностями при постановке реакций;
    а) Ложноположительные и ложноотрицательные результаты РМП
    РМП не является строго специфической реакцией на сифилис. Реагиновые антитела (неспецифические иммуноглобулины класса IgG и IgM) у больного сифилисом являются комплексным ответом на высвобождение липоидных молекулярных фрагментов из поврежденных клеток хозяина, с одной стороны, и на появление липопротеиноподобных структур, сходных с кардиолипином, входящих в состав бактериальной клетки бледной трепонемы, с другой стороны. 

    Антитела, выявляемые с помощью РМП в сыворотке крови людей, нередко могут быть обнаружены при системных поражениях паренхиматозных органов (печени, почек, легких), при инфаркте миокарда, сотрясении мозга, атеросклерозе, коллагенозах, при онкологических заболеваниях, ряде инфекций (туберкулез, сыпной тиф, малярия, лепра), при ревматизме, некоторых патологических и физиологических состояниях (тиреотоксикоз, беременность, менструация). 

    Положительные результаты в РМП наблюдают после злоупотребления алкоголем, приема жирной пищи, некоторых лекарственных препаратов. Количество ложноположительных результатов увеличивается при исследовании образцов крови пожилых людей. 

    Ложноположительные результаты РМП могут отмечаться при острых (малярия, лептоспироз и др.) и хронических (туберкулез, лепра, вирусный гепатит, боррелиоз и др.) инфекциях, инфаркте миокарда, циррозе печени, коллагенозах (особенно при системной красной волчанке), онкопатологии, вакцинации, употреблении наркотиков, злоупотреблении алкоголем и жирной пищей. Ложноположительными могут быть результаты РМП во время беременности, после родов, а у некоторых женщин и во время менструации. 

    Наряду с ложноположительными результатами возможны и ложноотрицательные результаты нетрепонемных тестов в серонегативной фазе первичного сифилиса: 
    • при избытке антител (феномен прозоны) либо при выраженной иммунной недостаточности; 
    • у больных вторичным сифилисом с симптомами злокачественности; 
    • при приеме иммунодепрессантов, 
    • в некоторых случаях ложноотрицательные результаты связаны с присутствием ВИЧ-инфекции
    б) Ложные результаты теста РМП, возникшие как следствие технических ошибок
    Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном является относительно несложным исследованием; тем не менее при ее выполнении необходимо соблюдать все рекомендации производителей диагностикума и правила работы в клинико-диагностической лаборатории.

    На достоверность результата исследования непосредственное влияние оказывают технические погрешности при постановке РМП:
    •  при взятии крови из пальца образуются пузырьки воздуха в капилляре, что приводит к ошибке объема пробы;
    •  отсутствие контроля качества исследования – исключение из протокола исследования постановки контрольной сыворотки;
    •  использование двухвалентного цитрата натрия вместо трехвалентного цитрата натрия при взятии образца крови;
    •  нарушение процедуры перемешивания приготовленной суспензии до равномерного распределения антигена;
    •  нарушение правил использования посуды, пипеток, учитывая невозможность повторного использования одноразовой посуды;
    •  несоблюдение протокола исследования.

    Источником ошибок при постановке РМП могут являться и следующие моменты:
    • исследование в реакции гиперлипидемичной, гемолизированной сыворотки крови или образцов с признаками бактериального пророста;
    • нарушение технологии взятия крови из пальца с целью получения плазмы крови (наличие пузырей воздуха в капилляре пипеток);
    • исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности, слабоположительных;
    • неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием;
    • бактериальное загрязнение эмульсии;
    • нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена и его эмульсии, растворов;
    • замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным;
    • использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, плас¬тинок, растворов;
    • недостаточная тщательность выполнения последовательных двукратных разведе¬ний;
    • нарушение методики постановки РМП, выражающееся в отказе от добавления физиологического раствора в реакционную среду перед учетом результатов реакции.
    Все вышеперечисленное обусловлено отсутствием стандартизации метода при его выполнении в ручном режиме. Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению и регистрации как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.

    8. Ограничения на применение теста РМП

    В связи с вышесказанным, РМП нельзя использовать в качестве единственного метода при исследовании на сифилис беременных женщин; пациентов кардиологических, неврологических, психоневрологических и офтальмологических стационаров; доноров крови и тканей; ВИЧ-инфицированных лиц. 

    Поэтому проведение скринингового обследования населения с использованием нетрепонемного теста на определение титра антител методом РМП является недостаточным и требует обязательного параллельного использования трепонемного теста – определения антител методами реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) или иммуноферментного анализа (ИФА). 

    В общем случае, для определения специфического характера положительных результатов исследования крови в РМП служат подтверждающие реакции, основанные на использовании антигенов бледной трепонемы (ИФА, РПГА, РИФ, РИТ)

    RPR - быстрый плазмареагиновый тест

    RPR сифилис
    Быстрый плазмареагиновый тест RPR — это быстрый тест для качественного и количественного определения реагиновых антител в сыворотке или плазме крови. Его относят к макроскопическим нетрепонемным флоккуляционным тестам по выявлению антител, ассоциированных с сифилисом. 

    1. История метода
    Эта реакция была разработана J.Portnoy и соавторами (1957) для массового и быстрого скрининга населения с использованием образцов сыворотки или плазмы. Реакция проводится на пластиковых планшетах с впечатанными кружочками. 

    2. Принцип метода
    При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом суспензии стабилизированного кардиолипинового антигена в смеси с мелкодисперсными частицами древесного угля происходит образование комплексов антиген-антитело, собирающих частицы древесного угля в более крупные агрегаты; при этом результат реакции становится возможным учитывать невооруженным глазом.

    3. Постановка теста
    Авторы метода в 1961 году предложили модификацию RPR на специальных картонных карточках с выдавленными круглыми плоскими неглубокими лунками диаметром 18 мм.

     Капля исследуемого образца (неразведенная плазма или сыворотка крови) смешивается в лунке с каплей стабилизированного стандартного кардиолипинового антигена, в который добавлены частицы мелкодисперсного угля (RPR-антиген). Затем в течение 8 мин планшету вращают на орбитальном ротаторе со скоростью 100 об./мин, чем достигается стандартизация условий равномерного перемещения нанесенных реагентов. В состав набора входят положительный и отрицательный контроли. Учет результатов проводится при хорошем освещении, когда еще не высохла поверхность кружка. При образовании комплексов антиген-антитело мелкодисперсные частицы угля попадают в образовавшуюся сеть и коагулируют.

    Rapid Plasma Reagins
    Для определения специфического характера позитивных результатов исследования крови в RPR проводят дополнительные исследования в подтверждающих реакциях, основанных на применении антигенов бледной трепонемы (ИФА, РПГА, РИФ, РИТ).

    4. Учет результатов

    Результаты RPR-теста: 

    «положительный» — при обнаружении средних и больших агрегатов, 
    «слабоположительный» — выявляются редкие небольшие агрегаты, 
    «отрицательный» — ровная серая поверхность без видимых агрегатов. 

    При положительных результатах рекомендуется исследовать RPR-тест в полуколичественной постановке (разведения от 1:2 до 1:1024). 

    5. При каких периодах заболевания лучше использовать
    Реакция становится положительной спустя 2—4 недели после появления твердого шанкра.

    Ограничениями применения метода RPR являются ранние стадии сифилиса (период инкубации, начало первичного периода), так как данная реакция становится позитивной лишь спустя 2—4  недели после появления твердого шанкра, и поздние стадии (поздний скрытый и третичный сифилис), так как лабильные преципитины первыми элиминируются из организма при длительном течении сифилитической инфекции.

    6. Чувствительность и специфичность
    Специфичность RPR-теста составляет 98%, а чувствительность зависит от стадии заболевания: при первичном сифилисе — 86%, при вторичном — 100%, при скрытых формах — 98%, при позднем сифилисе — 73% (Кунгуров Н.В. и соавт., 2002). 

    7. Область применения метода
    Применение указанной реакции при серодиагностике сифилиса регламентировано Приказом Минздрава РФ №87 от 26 марта 2001 года «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (приложением №1 «Постановка отборочных и диагностических тес¬тов на сифилис»).

    Содержание антител-преципитинов в крови после адекватного специфического лечения сифилиса постепенно понижается, что находит отражение сначала в снижении титров, а затем и степени позитивности RPR, которая из резко положительной становится слабоположительной, а затем — отрицательной. В связи с этим RPR используют для оценки эффективности лечения и как один из критериев установления излеченности или при дифференциальной диагностике реинфекции.

    8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

    Ложноотрицательные результаты. Точно так же, как и в тесте VDRL, при постановке RPR «феномен прозоны» может наблюдаться при постановке с выоскореактивными образцами сывороток. Этот эффект иногда возникает при анализе сывороток, взятых у больных вторичным сифилисом. Поэтому при постановке рекомендуется титрование до тех пор, пока результат не станет однозначным, особенно в случае позитивности трепонемного теста для этого же пациента. 

    Ложноположительные результаты (ЛПР) могут быть острыми и хроническими, в зависимости от того, насколько долго они сохраняются: острые — менее 6 месяцев, хронические — 6 месяцев и более. 
    Причины острых ЛПР: гепатит, мононуклеоз вызыванный вирусом Эпштейн-Барра, вирусная пневмония, малярия, прививки, беременность, сердечно-сосудистые заболевания, технические ошибки при постановке реакции.
    Причины хронических ЛПР: болезни соединительной ткани, болезни иммунной системы, наркомания, лепра, туберкулез, онкопатология, ВИЧ-инфекция, сердечно-сосудистые заболевания, многочисленные переливания крови.

    Технические причины ошибочных результатов теста RPR
    Реакция быстрого определения реагинов плазмы крови с кардиолипиновым антигеном является относительно несложным исследованием; тем не менее при ее выполнении необходимо соблюдать все рекомендации производителей диагностикума и правила работы в клинико-диагностической лаборатории.

    Источником ошибок при постановке RPR могут являться следующие моменты:
    исследование в реакции гиперлипидемичной, гемолизированной сыворотки крови или образцов с признаками бактериального пророста;
    исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности, слабо-положительных;
    неравномерная концентрация антигена в диагностикуме вследствие недостаточного его перемешивания перед использованием;
    нарушение сроков учета результатов реакции, подсыхание реакционной среды на пластинах с формированием псевдофлоккулятов в краевой зоне;
    нарушение сроков и условий хранения антигена и физиологического раствора; использование диагностикума с истекшим сроком годности;
    несоблюдение параметров работы орбитального шейкера (скорости и времени вращения);
    использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, наконечников пипеточных дозаторов, реакционных пластинок, растворов;
    недостаточная тщательность выполнения последовательных двукратных разведений.

    Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.

    9. Особенности, преимущества и недостатки
    Методика исследования в RPR проста в исполнении, недорога, не требует специального оборудования и не занимает длительного времени; при этом реакция демонстрирует высокую чувствительность и специфичность. Большинство исследователей отмечают самую высокую чувствительность RPR среди нетрепонемных тестов при всех стадиях сифилиса.

    Важным условием является то, что все производимые в мире RPR-наборы являются стандартизированными, что делает их результаты сопоставимыми. Вместе с тем положительные результаты RPR-теста не могут безоговорочно трактоваться как наличие сифилитической инфекции в организме исследуемого пациента без подтверждения трепонемными тестами. RPR-тест непригоден для исследования спинномозговой жидкости.

    RPR-тест не является строго специфической реакцией на сифилис. В сыворотке крови людей реагиновые антитела нередко обнаруживают при системных поражениях паренхиматозных органов (печени, почек, легких), при инфаркте миокарда, пневмонии, сотрясении мозга, атеросклерозе, при коллагенозах, онкологических заболеваниях, ряде инфекций (туберкулезе, сыпном тифе, малярии, лепре), при ревматизме, некоторых патологических и физиологических состояниях (тиреотоксикозе, беременности, менструации). Положительные результаты RPR наблюдают после злоупотребления алкоголем, приема жирной пищи, на фоне медикаментозной терапии. Количество ложноположительных результатов увеличивается при исследовании образцов крови пожилых людей.

    VDRL

    Одним из лучших стандартных методов, в которых используются липоидные антигены, является рекомендуемая ВОЗ реакция VDRL. Название этой реакции обусловлено заглавными буквами учреждения, где она была разработана — Venereal Diseases Research Laboratory в Атланте, штате Джорджия, США

    1. История метода

    Первая успешная попытка стандартизации и создания метода для массового скрининга - микрофлокулляционного теста VDRL – была проведена A. Harris, A. Rosenberg, L. Riedel в 1946 году.

    2. Принцип метода

    3. Постановка теста

    Микрофлокуляционный тест VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) ставится с инактивированной сывороткой крови (или спинномозговой жидкостью) на стеклянных пластинках с лунками. Исследуемая инактивированная сыворотка и свежеприготовленный антиген смешиваются в  стеклянной лунке механическим вращением. Если в сыворотке присутствуют антитела к кардиолипиновому антигену, образуются агрегаты в виде коротких стержневидных структур. Образующийся комплекс «кардиолипиновый антиген-антитело» выявляется под микроскопом (одинаковые объектив и окуляр ×10). 

    Используется количественная модификация VDRL до разведения сыворотки 1:64. 

    Антиген для реакции VDRL включает 0,03 % кардиолипина, 0,9 % холестерина и 0,21 % лецитина. Его добавляют к инактивированной сыворотке больного, помещаемой на предметное стекло, которое затем вращают в течение 4 — 5 мин при комнатной температуре и сразу регистрируют результат: наличие в сыворотке реагинов вызывает макроскопически видимую флокуляцию. 

    Количественную оценку циркулирующих антител получают путем разведения сыворотки перед постановкой реакции в геометрической прогрессии: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. 

    4. Учет результатов

    Результаты могут быть выражены качественно или полуколичественно

    Результаты оценивают как «реактивные» - при выявлении крупных агрегатов, «слабореактивные» - при незначительной флокуляции, «нереактивные» - при ее отсутствии. 

    Количественная постановка реакции с серией двукратных разведений сыворотки физиологическим раствором позволяет получить данные об истинной реактивности сыворотки, а также определить титр (наивысшее разведение, дающее реактивность), значение которого служит базовой величиной реактивности. Изменения титра в процессе и после лечения, вплоть до серонегативации, используются в качестве критерия эффективности терапии. 

    5. На каких стадиях заболевания лучше использовать этот тест

    Реактоспособность сыворотки в реакции VDRL выявляется примерно через 4 недели после заражения сифилисом.

    Титры VDRL увеличиваются у пациентов с острой инфекцией, реинфекцией или реактивацией перенесенной инфекции, которая не лечилась должным образом. Примерно у 72-84% больных с первичным или вторичным сифилисом наблюдается снижение в 4 раза титра VDRL через 6 месяцев после начала правильного лечения. 

    6. Чувствительность и специфичность

    Специфичность VDRL в среднем составляет 98 %, чувствительность зависит от стадии сифилиса и составляет при первичном сифилисе 78 %, при вторичном – 100 %, при скрытом – 95 %, при позднем сифилисе – 71 % (S. Larsen с соавт., 1995).

    7. Область применения метода

    Количественная модификация постановки реакции VDRL позволяет проводить оценку эффективности лечения (после лечения идет снижение титров антител вплоть до серонегативации). 

    Для детей, инфицированных и проле ченных, антитрепонемные антитела сохраняются долго, и только значительное снижение VDRL позволяет проследить эффективность лечения.

    VDRL является единственным тестом, рекомендуемым для исследования спинномозговой жидкости.

    8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

    Ложноположительные результаты (биологическая неспецифическая реактивность) могут обусловливаться аутоантителами при заболеваниях с нарушениями иммунитета (красная волчанка, ревматизм, болезнь Шегрена, дисгаммаглобулинемия), а также при заболеваниях, связанных с усиленным разрушением клеточных ядер (малярия, пситтакоз, вирусная пневмония, карцинома). 

    При качественной постановке VDRL у 1–2 % больных вторичным сифилисом возможен ложноотрицательный результат (феномен прозоны). 

    9. Особенности, преимущества и недостатки

    Главными достоинствами реакции VDRL являются низкая стоимость, легкость постановки, быстрое получение результатов с довольно высокой чувствительностью и специфичное, хотя и меньшей, чем в реакции с трепонемным антигеном.

    10. Модификации метода

    USR - метод детекции реагинов в непрогретой сыворотке

    USR (Unheated Serum Reagins) — микрофлокуляционный тест определения активных реагинов плазмы. Этот тест отличается от VDRL модификацией антигена: в него добавлены холинхлорид и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). Этот антиген не нуждается в ежедневном приготовлении. USR-тест ставится как с непрогретой сывороткой, так и с плазмой. 

    Во флоккуляционном тесте с непрогретой сывороткой (unheated serum reаgins, USR) для определения активных реагинов плазмы крови используют стабильный антиген, не нуждающийся в ежедневном приготовлении. USR–тест – метод детекции реагинов в непрогретой сыворотке. Метод выполнен на основе модификации антигена, используемого в VDRL путем добавления холинхлорида и ЭДТА с целью стабилизации антигенного комплекса. Тест пригоден для определения реагиновых антител не только в сыворотке, но и в плазме крови, не требует прогревания биопроб. Как и в VDRL, результаты теста регистрируются при помощи микроскопа, лупы, агглютиноскопа.

    Специфичность теста – 93 - 99 %, чувствительность при первичном сифилисе – 80 %, вторичном – 100 %, скрытом – 95 %.  

    Считывание результатов проводится под микроскопом. Специфичность теста (по данным S. Larsen) равна 99 %, чувствительность при первичном сифилисе — 80 %, при вторичном — 100 %, при скрытом сифилисе — 95 %.

    К преимуществам USR – теста относится возможность исследования непрогретой плазмы, стабильность кардиолипинового антигенного комплекса, высокая чувствительность. В России применяется крайне редко.

    TRUST - тест с непрогретой сывороткой и толуидиновым красным

    Тест с непрогретой сывороткой и толуидиновым красным (toluidine red unheated serum test, TRUST), в котором к стабилизированному антигену добавлен азокраситель для лучшей визуализации результата.

    Фактически модификация микрофлоккуляционного нетрепонемного RPR–теста на карточках.  С целью оптимизации визуального учета (невооруженным глазом) результата для приготовления антигена используется мелкодисперсная суспензия водонерастворимого красителя толуидинового красного (иногда суданового черного).

    Реакция осуществляется с непрогретой сывороткой и плазмой крови, однако неприменима при исследовании спинномозговой жидкости. Время получения результата около 10 минут. Специфичность теста – 99 %. Чувствительность при первичном сифилисе составляет около 85 %, вторичном – 100 %, скрытом – 98 %.  В России применяется в небольшом количестве лабораторий.  

    Методика удобна, легко выполнима, нет затруднений в интерпретации результатов.

    RST - реагиновый скрининговый тест 

    RSТ – реагиновый скрининговый тест (reagin screen test, RST), фактически являющийся модификацией USR. В отличие от него, при отсутствии визуализации реакции антиген – антитело в нее добавляют липид – растворимую субстанцию.

      ТЕЛЕФОН  +7 (495) 970-30-92   ежедневно с 7.00 до 23.00

    МЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР "На Ленинском" ежедневно.

    Адрес: г. Москва, Ленинский проспект, дом 82, корпус 2
    Часы работы: Пн - Пт: с 10.00 до 20.00; Сб - Вс, праздники: с 11.00 до 18.00

    Телефон: 8 (495) 970-30-92  ЗВОНИТЕ!


    от ст.м. «Университет» - пешком до ул. Крупской, дом 2 (10 мин.)
    от ст. метро: «Новые Черемушки» - автобус № 1, 113, маршрутка № 550 
    до ост. «ул. Крупской» ( 5 мин.)          
    от ст. метро: «Октябрьская» (кольцевая), выход на Ленинский пр-т:                                          
    троллейбус- м4 и автобус- м1;  маршрутка № 62, 553 до ост. ул. Крупской (10 мин.) метро: Юго-Западная: троллейбус № 62; 84 (10 мин). 

    МЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР "На Самотечной"

    Прием по предварительной записи! Суббота, воскресенье.

    Телефон: 8 (495) 970-30-92  ЗВОНИТЕ!